Trong xét nghiệm ADN hài cốt liệt sĩ, ly trích ADN từ xương là mắt xích đầu tiên và có tính quyết định. Nếu không thu hồi được ADN hoặc ADN bị phân mảnh quá mức, chứa chất ức chế PCR hoặc nhiễm ADN ngoại lai, thì các bước PCR và giải trình tự phía sau đều không thể bù đắp được chất lượng mẫu đầu vào.
Xét nghiệm ADN hài cốt liệt sĩ là quá trình phân tích vật liệu di truyền còn lại trong xương, răng hoặc các mô bảo tồn nhằm xác định danh tính hoặc đánh giá quan hệ huyết thống với người thân còn sống.
Khác với mẫu máu tươi hay niêm mạc miệng, mẫu hài cốt đã trải qua quá trình phân hủy kéo dài. ADN bị đứt thành những đoạn ngắn, giảm mạnh về số lượng và chịu tác động lớn bởi hóa chất từ môi trường chôn cất.
Do đó, quy trình không đơn thuần là “đưa mẫu xương vào máy”. Một quy trình chuẩn hóa bắt buộc phải trải qua các bước: Lựa chọn mẫu – Làm sạch – Nghiền – Khử khoáng – Ly giải – Tinh sạch và Thu hồi ADN.
Vì sao xét nghiệm ADN từ xương hài cốt lại khó?
Xương là nền mẫu đặc biệt. ADN bị khóa trong cấu trúc khoáng hóa phức tạp và phải chịu đựng nhiều tác nhân làm suy giảm di truyền theo thời gian:
Các chuỗi DNA dài bị đứt gãy thành các đoạn siêu ngắn, gây khó khăn cho việc khuếch đại các đoạn PCR kích thước lớn.
Sau nhiều thập kỷ, lượng DNA còn tồn tại chỉ ở mức picogram, đòi hỏi kỹ thuật thu hồi gần như tuyệt đối.
Axit humic từ đất, hợp chất khoáng và canxi lắng đọng cản trở nghiêm trọng hoạt lực của enzyme Taq polymerase.
Không phải mọi vị trí xương đều giữ được ADN như nhau. Tình trạng bảo tồn, mức độ phong hóa, độ ẩm môi trường và nguy cơ nhiễm ADN vi khuẩn/người khai quật đều quyết định trực tiếp tới tỉ lệ thành công.
Ly trích ADN từ xương – Bước kỹ thuật quan trọng nhất
Nếu ADN đầu vào không đạt chuẩn, mọi công nghệ giải trình tự hiện đại phía sau đều vô hiệu.
Mục tiêu cốt lõi của quy trình ly trích ADN từ xương:
- Loại bỏ hoàn toàn thành phần vô cơ (loại canxi/khoáng) khỏi nền xương.
- Giải phóng ADN khỏi ma trận protein và liên kết khoáng chất.
- Tối đa hóa khả năng thu hồi các phân đoạn ADN cực ngắn.
- Loại bỏ triệt để các tác nhân ức chế phản ứng PCR.
- Đảm bảo vô trùng tuyệt đối, ngăn chặn triệt để nhiễm ADN ngoại lai.
Khảo sát mức độ phong hóa, độ xốp của xương để chọn đúng vị trí bảo tồn ADN tốt nhất (như xương ống, thân răng).
Mài bỏ lớp xương ngoại vi, xử lý hóa chất và chiếu xạ UV để tiêu diệt toàn bộ ADN nhiễm bẩn bên ngoài.
Xử lý xương thành dạng bột siêu mịn nhằm gia tăng tối đa diện tích tiếp xúc với dung dịch ly giải.
Sử dụng dung dịch EDTA kết hợp Proteinase K để phá hủy cấu trúc xương, giải phóng chuỗi ADN vào dung dịch.
Tách lọc ADN ra khỏi các chất ức chế bằng công nghệ màng silica hoặc hạt từ chuyên dụng.
Đánh giá nồng độ và mức độ phân mảnh của ADN bằng Real-time PCR trước khi chuyển sang bước tiếp theo.
So sánh hiệu quả ly trích ADN
PCR thất bại, không đọc được trình tự hoặc kết quả bị nhiễu do chất ức chế.
Thu hồi đầy đủ các đoạn ADN ngắn, loại sạch chất ức chế, đảm bảo đủ nguyên liệu cho phản ứng PCR và giải trình tự mtDNA chính xác.
Sau khi ly trích: PCR khuếch đại vùng ADN mục tiêu
Khi đã thu được ADN tinh sạch, bước tiếp theo là PCR (Polymerase Chain Reaction). Phản ứng này đóng vai trò nhân bản hàng triệu lần vùng ADN mục tiêu để tạo đủ số lượng cho thiết bị đọc trình tự.
→
Khử Khoáng
→
Ly Trích ADN
→
PCR
→
BigDye
→
Sanger / CE
Ứng dụng BigDye Terminator trong giải trình tự Sanger
Sau khi khuếch đại PCR, hóa chất BigDye Terminator được dùng trong phản ứng Cycle Sequencing. Phương pháp này đánh dấu từng nucleotide bằng các tín hiệu huỳnh quang riêng biệt.
Quy trình phân tích hoàn chỉnh tại Loci:
Ly trích ADN từ xương → PCR vùng mục tiêu → Xử lý sạch sản phẩm PCR → Phản ứng BigDye → Điện di mao quản (CE) trên máy ABI 3500→ Đọc Chromatogram → Xác định biến thể → Đối chiếu dữ liệu dòng mẹ của thân nhân.
Phân tích ADN ty thể (mtDNA) vùng HV1 và HV2
Trong xét nghiệm hài cốt cổ xưa hoặc bị phân hủy nặng, ADN ty thể (mtDNA) là công cụ tối ưu nhất. Mỗi tế bào chỉ có 2 bản sao ADN nhân nhưng sở hữu hàng nghìn bản sao mtDNA, giúp khả năng thu hồi thành công cao hơn rất nhiều.
VÙNG HV1
Hypervariable Region 1
Vùng biến đổi cao 1 trên mtDNA, giúp xác định các điểm đột biến đặc trưng được di truyền theo dòng mẹ (bà ngoại, mẹ, anh chị em cùng mẹ, bác/cậu con của bà ngoại).
VÙNG HV2
Hypervariable Region 2
Vùng biến đổi cao 2, kết hợp cùng HV1 tạo nên bộ dữ liệu trình tự hoàn chỉnh, gia tăng độ phân giải và độ chính xác khi so sánh mẫu hài cốt với mẫu đối chứng của thân nhân.
Bảng giá xét nghiệm ADN hài cốt liệt sĩ tại Viện Loci
Chi phí xét nghiệm ADN hài cốt phụ thuộc vào số lượng mẫu,
tình trạng mẫu và thời gian yêu cầu trả kết quả.
| Nội dung | Tiêu chuẩn | Cấp tốc |
|---|---|---|
| 01 mẫu xương + 01 mẫu người thân | 9.000.000 VNĐ | 15.000.000 VNĐ |
| Thời gian trả kết quả | 7 ngày | 4 ngày |
| Mẫu xương thứ 3 | 5.000.000 VNĐ | 5.000.000 VNĐ |
Cam kết dịch vụ tại Viện Loci:
Để đồng hành và chia sẻ cùng các gia đình, Viện Loci áp dụng chính sách chỉ thu phí khi xét nghiệm ra kết quả. Trường hợp mẫu hài cốt bị phân hủy nặng và không thể ly trích được ADN, Quý khách sẽ không phải trả bất kỳ khoản chi phí nào trước đó.
FAQ dành cho thân nhân
Mẫu xương hài cốt nào cho tỷ lệ tách chiết ADN thành công cao nhất?
Xương ống (xương đùi, xương cẳng chân) còn nguyên vẹn, ít bị xốp/mục hoặc răng (đặc biệt là răng cối còn nguyên chân răng và men răng) có tỷ lệ thu hồi ADN cao nhất do cấu trúc bảo vệ tốt hơn các loại xương xốp khác.
Hài cốt liệt sĩ đã hy sinh và chôn cất từ 40–50 năm có xét nghiệm ADN được không?
Hoàn toàn có thể. Nhờ công nghệ tách chiết ADN ty thể (mtDNA) của Viện Loci, ngay cả các mẫu bị phân hủy mạnh chỉ còn lượng ADN rất nhỏ vẫn có thể phân tích thành công.
Xét nghiệm ADN hài cốt liệt sĩ thì cần lấy mẫu đối chứng của ai trong gia đình?
Do sử dụng phân tích ADN ty thể (di truyền theo dòng mẹ), mẫu đối chứng tốt nhất là: Mẹ đẻ, bà ngoại, anh/chị/em cùng mẹ, bác/cậu (con của bà ngoại), hoặc con của chị/em gái cùng mẹ.
Thời gian trả kết quả xét nghiệm ADN hài cốt mất bao lâu?
Quy trình xử lý xương vô trùng, khử khoáng, ly trích và giải trình tự phức tạp hơn nhiều so với mẫu máu/mô tươi, thường kéo dài từ 7 đến 14 ngày làm việc (hoặc lâu hơn tùy thuộc vào độ mù/mục của mẫu).
Tại sao một số trường hợp xương liệt sĩ không thể thu được ADN?
Do điều kiện thổ dưỡng (đất chua, vùng ngập nước, nhiều vi khuẩn/nấm), nhiệt độ cao, hoặc hài cốt bị cháy/tác động hóa chất mạnh khiến cấu trúc ADN bị đứt gãy hoàn toàn thành các nucleotit tự do, không còn đoạn mẫu đủ dài để PCR khuếch đại.
Bạn đang có mẫu hài cốt cần xét nghiệm ADN?
Hãy liên hệ Viện sinh học phân tử Loci để được tư vấn
loại mẫu xương/răng, phương án thu mẫu, khả năng ly trích ADN
và lựa chọn xét nghiệm phù hợp.
Viện sinh học phân tử Loci
Xét nghiệm ADN – Giám định ADN hài cốt – Phân tích huyết thống
