Skip to content
Gian lận thực phẩm là một chủ đề nóng hiện nay và ngày càng gia tăng. Các nước đang phát triển chịu ảnh hưởng nặng nề của vấn đề này. Nhiều loại thực phẩm khác nhau bị làm giả trên toàn thế giới, ví dụ như gia vị, ngũ cốc, trái cây, sữa, dầu, bơ ghee, các sản phẩm bánh mì, rau, mật ong, cá, mật ong, gạo và đặc biệt là thịt Thịt là một phần thiết yếu trong dinh dưỡng của con người vì nó giàu protein và các thành phần quan trọng khác cần thiết cho cơ thể con người. Do nhu cầu về thịt ngày càng tăng và lượng thịt ngày càng giảm nên tỷ lệ làm giả và thay thế thịt đã tăng lên. Làm giả thịt là những vấn đề nghiêm trọng liên quan đến sức khỏe, tôn giáo, đạo đức và [4-6]. Pakistan là một quốc gia Hồi giáo có đa số dân theo đạo Hồi và tuân theo các quy tắc ăn kiêng theo đạo Hồi. Làm giả thịt là một vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng chủ yếu đến người Hồi giáo. Người Hồi giáo chỉ ăn thịt halal và thịt từ các sinh vật haram như lợn, chó, lừa, mèo, v.v. bị cấm trong đạo Hồi Những sinh vật này cũng có khả năng mang các bệnh truyền nhiễm từ động vật sang người khác [8]. Vấn đề này đã tạo ra cảnh báo đỏ cho người Hồi giáo và tính xác thực và việc xác định thành phần thực phẩm trở nên cần thiết trước khi tiêu thụ thực phẩm
Thịt khi bán tươi có thể được nhận dạng và phân biệt dễ dàng, tuy nhiên, thịt nấu chín, chế biến và thịt băm không thể phân biệt được trong sản phẩm cuối cùng nên tỷ lệ pha tạp cũng cao Các trường hợp pha tạp thịt đang gia tăng theo thời gian và hiện nay cần phải giải quyết vấn đề này và bảo vệ người tiêu dùng và nhà sản xuất khỏi rơi vào cái bẫy pha tạp thịt này. Vì Pakistan là một quốc gia Hồi giáo, nên công dân của nước này cũng cần chứng nhận sản phẩm mà họ tiêu thụ. Các thành phần được sử dụng trong thực phẩm không thể phân biệt và phân biệt bằng cách kiểm tra trực quan đơn giản, do đó cần có các quy trình phân tử phức tạp
Nhiều phương pháp và nghiên cứu phân tích khác nhau đã được thực hiện để xác định nguồn gốc thịt và điều tra tình trạng pha tạp thực phẩm. Các phương pháp phát hiện tình trạng pha tạp thịt thường dựa trên các yếu tố vật lý, hóa học, sinh học và các yếu tố khác. Thông thường để phát hiện thực phẩm, người ta sử dụng hai loại phương pháp (a) dựa trên protein và (b) dựa trên DNA
Các phương pháp dựa trên protein bao gồm xét nghiệm điện di, điện di gel natri lauryl sulfat-polyacrylamide (SDS-PAGE) [14,15], các kỹ thuật miễn dịch [16], xét nghiệm miễn dịch hấp thụ [17,18], các kỹ thuật sắc ký [19] và các kỹ thuật khối phổ. Trong khi các kỹ thuật dựa trên DNA bao gồm phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và PCR thời gian thực (RT-PCR)
Mặc dù có nhiều ưu điểm, phân tích protein vẫn có một số hạn chế nhất định. Mặc dù các phương pháp dựa trên protein có hiệu quả trong phân tích thịt tươi, protein dễ bị biến tính bởi muối, nhiệt và áp suất và do đó có hiệu quả thấp trong thực phẩm chế biến nhiều [10]. Các sản phẩm được xử lý nhiệt có protein bị biến tính gây cản trở trong phân tích protein. Phân tích xét nghiệm miễn dịch dựa trên kháng thể chống lại các protein khác nhau trong khi phản ứng chéo xảy ra giữa các loài khác nhau [9]. Những hạn chế này dẫn chúng ta đến phân tích DNA. DNA là một phân tử ổn định và có nhiều hơn so với protein. DNA có mặt giống hệt nhau trong mỗi tế bào của sinh vật, vì vậy bất kỳ bộ phận nào của sinh vật đều có thể được sử dụng làm nguồn. Những đặc tính này làm cho DNA trở thành nguồn tốt cho các quá trình nhận dạng khác nhau. Sự thoái hóa của DNA là một điểm cộng cho việc nhận dạng và phân biệt các loài bằng phân tích DNA
Các kỹ thuật dựa trên DNA bao gồm phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và lai DNA. Lai DNA là quá trình lai các đầu dò DNA được gắn nhãn với DNA của nguồn được liên kết cộng hóa trị với màng. Điều này được xác định bằng các kỹ thuật phát hiện khác nhau như mảng DNA và PCR thời gian thực
PCR được ưa chuộng hơn các kỹ thuật khác vì một số tính chất nhất định của nó, tức là đặc hiệu, nhạy cảm, ít tốn thời gian hơn và dễ sử dụng hơn so với các kỹ thuật khác [22]. Có 2 loại mục tiêu DNA được sử dụng trong PCR là DNA nhiễm sắc thể và DNA ty thể. Cả hai đều có mặt bên trong tế bào. DNA ty thể (mt-DNA) chiếm đa số so với DNA nhiễm sắc thể và hầu hết các phương pháp nhận dạng đặc hiệu loài đều liên quan đến nó vì nó chứa các gen đánh dấu giúp nhận dạng sinh vật [23]. DNA ty thể rất phong phú và có số lượng bản sao cao trái ngược với DNA hạt nhân vì mỗi ty thể có 2-10 DNA Mt. Sự hiện diện của ty thể trong mỗi tế bào là rất lớn, gần 1000 ty thể trên một tế bào, do đó, nó rất hữu ích cho phân tích thịt chế biến và kích thước mẫu ngắn Tốc độ tiến hóa của nó cũng cao, giúp phân biệt các sinh vật có quan hệ họ hàng gần [24,25]. Gen cytochrome b là một gen ty thể được sử dụng làm dấu hiệu cho mục đích nhận dạng [26]. Các biến thể giữa các loài và trong loài của nó giúp xác định sinh vật và cũng phân biệt các sinh vật có quan hệ gần gũi
Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện để xác định thịt sống bằng gen ty thể tức là gen cyt b. Điều này là do tình trạng gian lận thịt gia tăng ở Pakistan.
Trích xuất DNA bộ gen
DNA được chiết xuất từ cả bò và lừa với tỷ lệ thịt bao gồm; 1:0, 1:1,1:2, 1:4, 1:6, 1:8,1:10, 1:50 và 1:100. DNA cũng được chiết xuất riêng từ cả hai loài để đánh giá mức độ nhạy cảm. DNA được phân lập từ cả hai loài được đánh giá bằng phương pháp điện di gel Agarose. DNA được phân lập từ mẫu thịt đặc trưng của từng loài được hình dung dưới dạng các dải DNA nguyên vẹn (Hình 2A) trong khi DNA được chiết xuất từ các mẫu thịt hỗn hợp của cả hai loài với tỷ lệ nhị phân được hiển thị trong vết bôi cũng như dải nguyên vẹn
Ước tính gel sản phẩm khuếch đại
Sự khuếch đại DNA thông qua PCR đã được tối ưu hóa để có được các dải tốt nhất của các sản phẩm mong muốn. Các điều kiện khác nhau đã được thay đổi tức là nhiệt độ gắn, nồng độ Taq polymerase, nồng độ mồi và hỗn hợp chính đã được thay đổi. Kết quả tốt nhất thu được ở 60 °C cùng với đệm hỗn hợp chính Hot-start và Taq polymerase của ThermoFisher USA. Tỷ lệ lừa và bò được khuếch đại riêng biệt với từng loại mồi riêng biệt. Sự khuếch đại của gen cyt b ty thể mục tiêu từ mẫu thịt bò biểu thị dải PCR có 309 bp
PCR đa mồi
PCR đa mồi cho gen cyt b mục tiêu đã được tiến hành với các tỷ lệ nhị phân khác nhau của bò và lừa để phát hiện mức độ nhạy cảm của PCR. PCR đa mồi đã phát hiện thành công cả hai loài trong hỗn hợp thịt. Trong tất cả các tỷ lệ 1-10 của cả hai loài, kết quả đều dương tính.
Nhiệt độ của tất cả các đoạn mồi là 60 °C. Điều kiện chu kỳ nhiệt của PCR giống như của PCR đơn giản. Sản phẩm PCR được đánh giá bằng điện di gel 2% và mẫu băng được hình dung bằng máy chiếu tia cực tím. PCR đa mồi khuếch đại vùng mục tiêu của Bò với băng PCR dài 309 bp và 475 bp của DNA Lừa
Việc làm giả thịt là một vấn đề đang nổi lên hiện nay và việc phát triển một số kỹ thuật xác thực để phát hiện nguồn gốc loài là một thách thức lớn [28].
Phân tích protein và các kỹ thuật dựa trên phân tử đã được sử dụng thành công để phát hiện sự pha trộn thịt. Các phương pháp dựa trên DNA tức là phương pháp PCR được ưu tiên để xác định nguồn gốc loài trong việc thay thế và pha trộn thịt sống [10] do thực tế là DNA ổn định, chịu được nhiệt độ, cung cấp nhiều thông tin hơn protein và có số lượng lớn [16,29].
Trong nghiên cứu này, DNA ty thể được sử dụng để phát hiện và nhận dạng loài từ thịt sống [26]. DNA ty thể được ưu tiên vì sự hiện diện của nó ở số lượng bản sao cao, chịu nhiệt tốt hơn và điều này làm tăng khả năng có kết quả dương tính ngay cả trong các mẫu có DNA bị phân hủy [30]. Nghiên cứu được tiến hành b [25] cho thấy kết quả có lợi cho việc sử dụng gen ty thể cho mục đích nhận dạng. Gen Cyt b được sử dụng do trình tự trong và giữa các loài của nó đóng vai trò đầy hứa hẹn trong phân tích phát sinh loài của các loài có quan hệ họ hàng gần và xa [28].
PCR đơn giản được thiết kế để xác định các loài đơn lẻ và kiểm tra độ nhạy của các đoạn mồi được thiết kế như mô tả bởi [10]. PCR có hiệu quả trong việc xác định nguồn gốc loài trong thịt sống. DNA từ các tỷ lệ thịt nhị phân khác nhau đã được chiết xuất và PCR được sử dụng để xác định loài từ tỷ lệ 1-10 trong hỗn hợp.
PCR đa mồi được thiết kế để xác định cả hai loài bò và lừa trong hỗn hợp đã cho kết quả thành công và điều này hữu ích trong việc xác định thịt bị pha tạp trong hỗn hợp thịt [8]. Độ đặc hiệu của PCR đa mồi và PCR đơn giản đã được kiểm tra bằng cách thay đổi lượng DNA theo tỷ lệ và kiểm tra độ nhạy và mức độ phát hiện của các mồi và phản ứng PCR.
Nghiên cứu được thiết kế này được sử dụng để kiểm tra sự pha trộn thịt lừa trong thịt bò và tìm mức độ nhạy cảm của các đoạn mồi và lượng chất pha trộn có thể phát hiện được trong hỗn hợp thịt. Các kết quả thu được có tương quan dương với kết quả của [8,28] cũng phát hiện ra nguồn gốc của năm loài thịt bằng cách sử dụng PCR đa mồi và cho thấy PCR đa mồi có thể phát hiện ra ngay cả một lượng nhỏ DNA hiện diện [31], tiến hành nghiên cứu và phát hiện ra nguồn gốc của các loài thịt bằng cách sử dụng PCR đa mồi của gen cyt b.
Kết luận rằng nghiên cứu này hữu ích trong việc xác định thịt giả trong hỗn hợp thịt bằng PCR đơn giản và PCR đa mồi. Ngay cả một lượng nhỏ DNA cũng được phát hiện bằng PCR và mất ít thời gian hơn và cho kết quả xác thực. Kết quả của nghiên cứu này là tích cực.
Đây là một nghiên cứu quy mô nhỏ dựa trên một lượng mẫu nhỏ. Kết quả có thể dao động dựa trên mức độ thương mại, vì vậy cũng nên kiểm tra trên quy mô lớn với số lượng mẫu lớn.
