Viện sinh học phân tử loci Ty thể đóng vai trò trung tâm trong quá trình chuyển hóa năng lượng của tế bào. DNA ty thể có tỷ lệ đột biến cao hơn so với DNA nhân và đột biến DNA ty thể là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây bệnh ở người. Một nhóm nghiên cứu thuộc bệnh viện Đại Học Y Dược TP.HCM đã thiết kế thành công 8 cặp mồi dùng để nhân bản toàn bộ 37 gen ở mtDNA từ đó tiến hành giải trình tự bằng phương pháp Sanger giúp phát hiện các đột biến trên DNA ty thể góp phần vào công tác chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền cho bệnh nhân và gia đình bệnh nhân mắc các bệnh lý rối loạn ty thể.
“Nhà máy năng lượng” ty thể
Ty thể là nhà máy năng lượng cho cơ thể chúng ta. Mỗi một tế bào có khoảng vài nghìn ty thể. Nhiệm vụ của nhà máy này là thực hiện quá trình hô hấp tế bào để chuyển hóa các chất từ thức ăn đã hấp thụ thành nguồn năng lượng. Ty thể sản xuất 90% năng lượng mà cơ thể chúng ta cần cho các hoạt động. Điều đặc biệt là ty thể có hệ DNA riêng (mtDNA) tồn tại ở dạng mạch kép vòng, có kích thước 16.569 bp, với 37 gen mã hóa cho 2 RNA ribosome, 22 RNA vận chuyển và 13 protein thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi truyền điện tử hô hấp tế bào. DNA ty thể (mtDNA) dễ bị hư hại do nó giàu các gốc oxy hóa tự do (ROS: reactive oxygen species) và thiếu cơ chế sửa sai hiệu quả dẫn đến nhiều đột biến xuất hiện trong mtDNA. Hầu hết các hoạt động của tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp, do đó những sai sót trong mtDNA có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống ảnh hưởng đến nhiều tế bào, mô và các cơ quan khác nhau.
Các bệnh lý ty thể
Bệnh lý rối loạn ty thể là bệnh lý trong đó khả năng sản xuất năng lượng và vai trò bình thường của ty thể trong tế bào bị tổn hại. Các bệnh lý rối loạn ty thể có ảnh hưởng đến nhiều cơ quan, tập trung chủ yếu vào cơ, hệ thần kinh, các cơ quan cần nhu cầu năng lượng cao và các chuyển hóa của cơ thể. Hiện nay, đã có nhiều bệnh lý rối loạn ty thể được phát hiện và nghiên cứu, bao gồm hội chứng MELAS (Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes), hội chứng MERRF (Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres), bệnh thần kinh thị giác di truyền Laber (LHON: Laber hereditary optic neuropathy), hội chứng Leigh, bệnh NARP (Neurogenic muscle weakness, ataxia, and retinitis pigmentosa), bệnh CPEO (Chronic progressive external ophthalmoplegia)… Biểu hiện lâm sàng của những bệnh lý này rất đa dạng, có những triệu chứng đan xen nhau. Sự khởi phát các triệu chứng lâm sàng, sự biến đổi kiểu hình và mức biểu hiện của bệnh lý rối loạn ty thể chịu sự chi phối của nhiều yếu tố như hiệu ứng ngưỡng, sự phân chia tế bào chất trong phân bào, số lượng bản sao DNA được nhân lên trong ty thể và sự di truyền “nút thắt cổ chai”. Do đó, bệnh có thể bắt đầu xuất hiện ngay sau khi sinh hoặc cũng có thể xảy ra ở bất kỳ lứa tuổi nào.
Theo ước tính tỷ lệ bệnh ty thể khoảng 1/5000 người. Cứ mỗi năm có từ 1000 đến 4000 trẻ em ở Mỹ sinh ra mắc bệnh lý ty thể. Do triệu chứng và nhiều hệ cơ quan bị ảnh hưởng nên các bệnh lý ty thể thường bị chẩn đoán nhầm sang các bệnh lý khác thông thường hơn. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh lý rối loạn ty thể để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng như tính di truyền của bệnh. Tuy nhiên, tại Việt Nam, ít có công trình nghiên cứu giải trình tự toàn bộ mtDNA. Do đó, nghiên cứu này nhằm góp phần vào công tác chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền cho bệnh nhân và gia đình bệnh nhân mắc các bệnh lý rối loạn ty thể.
Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự Sanger phát hiện các biến thể DNA ty thể
Tác giả Lê Khái Phương và các cộng sự đã tiến hành thiết kế primer khuếch đại toàn bộ 37 gen của DNA ty thể thông qua 8 phản ứng PCR. Sản phẩm PCR sau khi kết thúc chu trình luân nhiệt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5%, cho thấy các băng sản phẩm mục tiêu sáng rõ nét, không có band phụ (Hình 1). Sau đó, sau đó tiến hành giải trình tự 8 vùng gen này bằng phương pháp Sanger và thống kê các vị trí đột biến.
Trong 43 mẫu bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh lý liên quan rối loạn ty thể được giải trình tự DNA ty thể, đã phát hiện 19 trường hợp mang đột biến (chiếm tỷ lệ 44,19%), trong đó 01 trường hợp mang đột biến kép (xảy ra 2 đột biến đồng thời). Các dạng đột biến được mô tả trong Bảng 1 và Hình 2.
Trong 19 trường hợp phát hiện đột biến, m.3243A>G và m.3697G>A là những đột biến điểm liên quan đến hội chứng MELAS [1,2]. Sự thay đổi nucleotide A thành G tại vị trí 3243 trên gen MT-TL1 của DNA ty thể làm thay đổi bộ ba mã hóa trên tRNALeu, do đó giảm khả năng tương tác với bề mặt ribosome. Đột biến tại vùng này ảnh hưởng đến sự hợp nhất của dư lượng leucine vào protein ty thể, làm suy yếu tổng hợp protein và gây ra các rối loạn chức năng của chuỗi hô hấp trong ty thể. Trong khi đó, đột biến m.3697G>A xảy ra trên gen MT-ND1 có chức năng mã hóa các protein trong tiểu đơn vị của phức hợp I (NADH dehydrogenase) trong chuỗi truyền điện tử hô hấp tế bào. Đột biến này làm thay đổi glycine (amino acid có tính bảo tồn cao và nằm ở vị trí domain xuyên màng) thành serine tại vị trí 131. Do đó, các đột biến này làm ty thể giảm hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa, đặc biệt là các phức hợp I và IV (cytochrome C oxidase).
Đột biến m.8344A>G là đột biến điểm phổ biến liên quan hội chứng MERRF. Sự thay đổi nucleotide A thành G tại vị trí 8344 trên gen MT-TK làm thay đổi bộ ba mã hóa trên tRNALys. Hậu quả của đột biến này tương tự như đột biến m.3243A>G, tức là làm giảm khả năng tương tác giữa tRNALys với bề mặt ribosome, từ đó ảnh hưởng đến sự hợp nhất của dư lượng lysine vào protein ty thể
Đột biến m.3394T>C (p.Y30H) trên gen MT-ND1, đột biến m.12338T>C (p.M1T) và m.13708A>G (p.A458T) trên gen MT-ND5 đều được ghi nhận tồn tại ở dạng đồng tế bào chất hay đồng DNA ty thể (homoplasmy, các bản sao của DNA ty thể đều giống nhau) và có liên quan với bệnh LHON. Đặc biệt, đột biến m.13708A>G còn được ghi nhận làm tăng nguy cơ mắc bệnh Alzheimer và ung thư vú. Các đột biến này ảnh hưởng đến cấu trúc và sự ổn định của phức hợp I trong chuỗi truyền điện tử hô hấp tế bào, khiến cho quá trình tổng hợp ATP và điện thế màng ty thể giảm, tăng sản xuất ROS.
Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng đã ghi nhận 01 trường hợp mang SNP m.3970C>T trên gen MT-ND1. Biến thể này được ghi nhận trong quần thể người Mông Cổ ở Trung Quốc chiếm tỷ lệ 10,38%. Mặc dù biến thể này là một đột biến đồng nghĩa (không ảnh hưởng đến cấu trúc của protein) nhưng nhiều nghiên cứu cho rằng biến thể này có thể cùng với một vài biến thể khác tạo thành một haplotype làm tăng nguy cơ mắc bệnh tăng huyết áp, ung thư đại trực tràng, bệnh Behçet.
Ty thể là bào quan sử dụng oxy để chuyển hóa các sản phẩm trung gian của thức ăn thành năng lượng thông qua một quá trình phosphoryl oxy hóa. Những đột biến trên DNA ty thể gây ra các bệnh lý rối loạn ty thể như hội chứng MELAS, hội chứng MERRF, bệnh LHON… sẽ làm suy giảm khả năng của ty thể trong việc tạo ra các protein, sử dụng oxy và sản xuất năng lượng. Nhìn chung, những tác động của đột biến mtDNA lên bệnh nhân là khá đa dạng, phức tạp và không đồng nhất. Các rối loạn của các bệnh lý rối loạn ty thể ảnh hưởng đến nhiều bộ phận của cơ thể, đặc biệt cơ bắp và hệ thần kinh, triệu chứng xuất hiện từ thời thơ ấu hay tuổi vị thành niên. Vì vậy, việc phân tích mtDNA là quan trọng ở nhiều trường hợp có sự rối loạn hệ thống không rõ ràng.
Tại Việt Nam , các đơn vị y tế được trang bị chủ yếu là giải trình tự theo phương pháp Sanger, đề tài này giúp tận dụng nguồn cơ sở vật chất hiện có và hỗ trợ cho công tác chẩn đoán , điều trị bệnh, đồng thời tạo nguồn cơ sở dữ liệu gen ty thể của người Việt.
Nguồn:
Lê Khái Phương và CS, “ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ SANGER PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ DNA TY THỂ,” Tạp chí Y Học , tập 518, tháng 9, số 2 -2022.
