Ly trích axit nucleic bằng cột lọc

Tách chiết axit nucleic dựa trên cột lọc là một phương pháp chiết pha rắn nhanh chóng , hiệu quả. Phần lớn các bộ kit ly trích tay thương mại hiện nay đều dùng phương pháp ly trích cột lọc. Phương pháp này hạn chế tối đa trường hợp ức chế so với phương pháp phenol hay Boom. Bộ ly trích cột không đòi hỏi đầu tư cao ở trang thiết bị, phù hợp cho số lượng mẫu ly trích nhỏ, do đó được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và xét nghiệm.

 Phương pháp này dựa trên nguyên lý là axit nucleic sẽ liên kết với pha rắn của silica . Trong các đều kiện môi trường đệm khác nhau, màng lọc silica giữ lại DNA/RNA, các thành phần không mong muống được loại bỏ bằng lực quay ly tâm.

 

Nguyên tắc:

Các giai đoạn của phương pháp này là ly giải, kết dính, rửa và rửa giải. Cụ thể hơn, đầu tiên mẫu được xử lý với chất ly giải để giải phóng axit nucleic. Tùy vào loại mẫu ( tóc ,móng , máu, mô, mẫu thực vật, …), bước ly giải này sẽ thay đổi cho phù hợp. Bước 2, liên kết chọn lọc axit nucleic với màng silica. Sau khi , DNA/RNA đã gắn vào màng lọc của cột, tiến hành bước  rửa sạch các hạt và chất ức chế không. Sau cùng, rửa giải axit nucleic, với kết quả cuối cùng là axit nucleic được tinh chế trong dung dịch nước/ elution buffer.

Quy trình:

  • Bước 1- Ly giải: các tế bào (máu, mô, v.v.) của mẫu phải trải qua quá trình xử lý để phá vỡ màng tế bào và giải phóng axit nucleic. Tùy thuộc vào vật liệu mục tiêu, bước này có thể bao gồm việc sử dụng chất tẩy rửa hoặc chất đệm khác, proteinase hoặc các enzym khác, gia nhiệt đến các thời gian / nhiệt độ khác nhau, hoặc gián đoạn cơ học như cắt bằng dao hoặc máy đồng hóa, sử dụng cối và chày, hoặc hạt- đập bằng máy nghiền hạt.
  • Bước 2 – liên kết: mẫu đã ly giải cùng bổ sung etanol hoặc isopropanol giúp tạo liên kết với màng lọc. Sau đó, mẫu được chuyển sang cột quay (Cột lọc + Collection Tubes), và cột được đưa vào máy ly tâm hoặc được gắn vào máy hút chân không. Máy ly tâm / máy hút chân không ép dung dịch đi qua màng silica nằm bên trong cột spin, nơi ở điều kiện ion thích hợp, axit nucleic sẽ liên kết với màng silica, phần dịch không mong muốn di chuyển xuống collection tubes.
  • Bước 3 – rửa: Đây là bước loại bỏ các thành phần còn sót lại từ quá trình ly trích như protein, polysaccharide, các loại vật chất nội bào nhằm đạt hiệu suất tách chiết và tinh sạch ADN/ ARN. Mẫu sẽ được rửa 2-3 lần trong dung dịch chứa ethanol / isopropanol. Dung dịch đệm này nhằm duy trì các điều kiện liên kết của ADN/ ARN với màng, và loại bỏ các muối liên kết và các chất bẩn còn lại khác sau quá trình ly tâm. ‘Bước Rửa’ cuối cùng thường là bước quay khô để cồn bay hơi, chỉ còn lại các axit nucleic tinh khiết gắn vào cột.
  • Bước 4-  rửa giải:  để hoàn nguyên DNA/RNA , cột được chuyển vào một tube sạch trước khi thực hiện bước ly tâm cuối cùng.Cho dung dịch đệm rửa giải (elution buffer) vào cột, axit nucleic ưa nước rời khỏi cột và trở lại dạng dung dịch. Đối với ADN, do đặc tính ổn định ở môi trường pH kiềm nhẹ và tan nhanh trong đệm nên đệm Tris HCl 10mM ở pH nằm trong khoảng 8-9 thường được sử dụng làm đệm rửa giải. Ngược lại ARN lại ổn định tốt trong môi trường pH acid nhẹ và hòa tan hoàn toàn trong nước nên nước là dung dịch phù hợp để rửa giải (pH của nước thường nằm trong khoảng 4-5). Quá trình rửa giải đạt hiệu quả cao nếu cho dung dịch rửa giải vào và chờ 1-2 phút rồi mới đem ly tâm thu dịch.

Kết luận:

 Phần lớn các bộ kit ly trích tay thương mại hiện nay đều dùng phương pháp ly trích cột lọc. Phương pháp này cho thấy những ưu điểm như: Hạn chế tối đa trường hợp ức chế so với phương pháp phenol hay Boom; Không đòi hỏi đầu tư cao ở trang thiết bị, phù hợp cho số lượng mẫu ly trích nhỏ, được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và xét nghiệm.Tuy nhiên vẫn có những hạn chế như thao tác nhiều bước, sử dụng cột lọc và lực ly tâm, do đó không phù hợp cho số lượng mẫu ly trích lớn ( mẫu mô, mẫu bùn đất…), không thể áp dụng mô hình tự động hóa.

Nguồn : https://en.wikipedia.org/wiki/Spin_column-based_nucleic_acid_purification

Tin khác

Đối tác

Copyright 2017 ADN LOCI