Kỹ thuật tách chiết pha rắn

Phân lập / tinh sạch DNA là một quy trình được sử dụng rộng rãi cho sinh học phân tử, nghiên cứu y tế, liệu pháp gen và đặc biệt là các phản ứng PCR cần mẫu axit nucleic chất lượng cao hoặc cực kỳ tinh sạch. Tách chiết axit nucleic chủ yếu được thực hiện bằng hai phương pháp: Phương pháp ly trích bằng dung môi và phương pháp ly trích pha rắn (Solid-phase extraction – SPE). Mặc dù phương pháp chiết xuất bằng dung môi là phương pháp đơn giản, nhưng có một số hạn chế như độc tính, yêu cầu nhiều dung môi hơn, quy trình tốn thời gian và độ đặc hiệu thấp. Ngày nay, người ta sử dụng rộng rãi chất nền pha rắn để tách chiết DNA từ nhiều loại mẫu khác nhau. Trong bài viết đánh giá này; về cơ bản chúng tôi tập trung vào các phương pháp ly trích pha rắn  SPE khác nhau

Ly trích pha rắn (Solid-phase extraction – SPE) là một trong những kỹ thuật ly trích nucleic acid hiệu quả và đang được sử dụng phổ biến trong hầu hết các bộ dụng cụ chiết xuất thương mại có sẵn trên thị trường. Nó cho phép thanh lọc nhanh chóng và hiệu quả so với các phương pháp thông thường. Có thể ngăn ngừa được nhiều vấn đề liên quan đến quá trình chiết lỏng-lỏng như tách pha không hoàn toàn, hóa chất độc hại… Hệ pha rắn sẽ hấp thụ axit nucleic trong quá trình chiết xuất tùy thuộc vào độ pH và hàm lượng muối của đệm. Quá trình hấp thụ dựa trên các nguyên tắc sau: tương tác liên kết hydro với chất nền ưa nước trong điều kiện chaotropic, trao đổi ion trong điều kiện nước bằng chất trao đổi anion, và cơ chế loại trừ ái lực và kích thước.

Quá trình tinh chế pha rắn thường được thực hiện bằng cách sử dụng cột quay, hoạt động dưới lực ly tâm hoặc lực hút từ trường. Phương pháp này có thể làm sạch axit nucleic nhanh chóng so với các phương pháp thông thường. Chất nền silica, hạt thủy tinh, đất diatomit và chất mang trao đổi anion là những ví dụ đã được sử dụng trong phương pháp chiết pha rắn làm chất hỗ trợ rắn. Bốn bước quan trọng liên quan đến chiết xuất pha rắn là ly giải tế bào, hấp phụ axit nucleic, rửa và rửa giải.

Có nhiều dạng vật liệu pha rắn khác nhay dùng trong ly trích DNA/RNA như: Silica, hạt thủy tinh, bột tảo cát (Diatomaceous Earth, Kieselguhr,  Diatomit), hạt từ , vật liệu trao đổi anion. Một số phương pháp ly trích dựa trên các vật liệu rắn này:

  • Phương pháp Boom

Năm 1990, Boom và cộng sự công bố phương pháp ly trích DNA bằng silica trong môi trường muối chaotropic.

Nguyên tắc: Hạt silica tích điện dương hấp thụ DNA/RNA tích điện âm. Trong điều kiện khác nhau về pH và thành phần muối của môi trường đệm, các yếu tố không cần thiết được loại bỏ dần trong quá trình rửa với các đệm chaotropic khác nhau. Giai đoạn cuối cùng , để rửa giải thu hồi DNA/RNA , ta sử dụng sử dụng đệm TE hoặc nước cất cường độ ion thấp (pH ≥7) giúp giải phóng DNA/RNA.  

Silica tồn tại ở dạng tinh thể SiO2 và một số dạng hóa học khác như oxit silic vô định hình và bột thủy tinh, alkylsilica, silicat nhôm (zeolit) hoặc silica gắn nhóm -NH2. Quy trình hydrat hóa silica tạo hạt silica ngậm nước tích điện dương sử dụng cho ly trích DNA được đăng ký patent vào năm 1994 bởi Woodard và cộng sự.

 

Hình 1 : Ly trích bằng silica

– Ưu điểm: Là phương pháp được sử dụng phổ biến. Nhiều phương pháp ly trích ra đời trên cơ sở cải tiến từ phương pháp Boom. Khắc phục được một số hạn chế của ly trích pha lỏng, hạn chế ức chế.

– Nhược điểm: 4 giai đoạn thao tác ly giải, hấp thu, rửa và rửa giải dẫn đến quy trình ly trích nhiều bước, kỹ thuật viên thao tác dễ có nhầm lẫn, sai sót.

  • Phương pháp magnetic bead

Magnetic bead là những hạt từ tính được tạo thành từ các hạt ôxít sắt cực nhỏ (20 đến 30 nm), chẳng hạn như magnetit (Fe3O4), mang lại cho chúng đặc tính siêu thuận từ (là đặc tính cho phép các hạt được tách ra ở dạng huyền phù, cùng với bất cứ thứ gì chúng bị ràng buộc. Vì chúng không hút nhau bên ngoài từ trường, chúng có thể được sử dụng mà không cần lo lắng về sự kết tụ không mong muốn).

Tiềm năng của hạt từ trong ly trích axit nucleic đã được công nhận vào những năm 1990 với việc cấp bằng sáng chế cho quy trình : “Tinh chế và phân lập DNA bằng cách sử dụng các hạt từ tính”. Cách tiếp cận, hầu như không thay đổi kể từ đó, dựa vào việc sử dụng các hạt từ tính với lớp phủ có thể liên kết các axit nucleic một cách thuận nghịch chỉ bằng cách điều chỉnh các điều kiện đệm (Hình 2). Tùy vào lớp phủ, hạt từ gắn kết vào các đối tượng đích khác nhau ( DNA, RNA, Protein, các phân tử miễn dịch…)

Quy trình ly trích tương tự phương pháp boom, ưu thế nổi trội của hạt mag bead là tính từ tính cho phép xây dựng hệ thống ly trích tự động / bán tự động.

Hình 2:Tổng quan về chiết xuất DNA dựa trên hạt từ tính bằng cách sử dụng hạt Sera-Mag.

https://www.cytivalifesciences.com/en/us/news-center/magnetic-beads-a-simple-guide-10001

  • Vật liệu trao đổi ion

Các vật liệu trao đổi ion được sử dụng nhiều trong phương pháp ly trích cột. Cột ly tâm chứa chất bám silica (silica resin) có kích thước lỗ lớn gắn với một số lượng lớn nhóm  DEAE tích điện dương trên bề mặt cho phép gắn chọn lọc DNA/ ARN/ plasmid (hình 3). Trong các đều kiện môi trường đệm khác nhau, màng lọc silica giữ lại DNA/RNA, các thành phần không mong muống được loại bỏ bằng lực quay ly tâm.

Ưu điểm: Phần lớn các bộ kit ly trích tay thương mại hiện nay đều dùng phương pháp ly trích cột lọc. Hạn chế tối đa trường hợp ức chế so với phương pháp phenol hay Boom. Bộ ly trích cột không đòi hỏi đầu tư cao ở trang thiết bị, phù hợp cho số lượng mẫu ly trích nhỏ, do đó được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và xét nghiệm.

Nhược điểm: Thao tác nhiều bước, sử dụng cột lọc và lực ly tâm, do đó không phù hợp cho số lượng mẫu ly trích lớn ( mẫu mô, mẫu bùn đất…) .

Hình 3: Tương tác giữa nhóm DEAE tích điện dương với DNA

https://www.qiagen.com/be/knowledge-and-support/knowledge-hub/technology-and-research/plasmid-resource-center/qiagen-anion-exchange-resin/

  1. Tổng kết

Tinh sạch DNA là bước quan trọng đối với các ứng dụng khác nhau như liệu pháp gen, ứng dụng lâm sàng hoặc y tế, vaccine, gen và nghiên cứu PCR. Ở đây, chúng tôi tóm tắt tinh sạch DNA bằng phương pháp SPE vì phương pháp SPE có nhiều ưu điểm, đặc biệt là chi phí thấp và hiệu quả thu hồi cao. Việc phát triển các kỹ thuật mới để tách chiết DNA, mang lại nhiều lợi thế khác nhau như giảm nhân công và chất thải, xử lý nhanh hơn với độ nhạy cao hơn, có thể là một tiềm năng phát triển trong tương lai.

Tin khác

Đối tác

Copyright 2017 ADN LOCI