Sự phát triển của các phương pháp ly trích DNA

Ly trích các phân tử sinh học (DNA, RNA hay protein) có thể xem phương pháp quan trọng được sử dụng trong sinh học phân tử. Nó là điểm khởi đầu cho các quy trình theo sau như chẩn đoán, định lượng, phân tích di truyền… DNA, RNA và protein có thể được phân lập từ bất kỳ vật liệu sinh học nào như các mô, tế bào, các phần tử virus sống hoặc đã qua bảo quản …

Để quá trình ly trích axit nucleic thành công đòi hỏi bốn bước quan trọng:

– Phá vỡ hiệu quả các tế bào hoặc mô;

– Biến tính của phức hợp nucleoprotein;

– Khử hoạt tính của nuclease, ví dụ, RNase để chiết xuất RNA và DNase để tách chiết DNA; tránh tạp nhiễm, ngoại nghiễm

– Tinh sạch: Axit nucleic đích phải không có chất gây ô nhiễm, ức chế bao gồm protein, carbohydrate, lipid hoặc axit nucleic khác, ví dụ: DNA không có RNA hoặc RNA không có DNA. Chất lượng và tính toàn vẹn của axit nucleic được phân lập sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả của tất cả các quá trình theo sau.

Mặt khác, quá trình ly trích RNA gặp một số khó khăn đáng kể. RNA là một phân tử không ổn định và có thời gian bán hủy rất ngắn khi được chiết xuất từ tế bào hoặc mô. RNA đặc biệt không ổn định do sự hiện diện phổ biến của RNase là các enzyme có trong máu, tất cả các mô, cũng như hầu hết vi khuẩn và nấm trong môi trường.  Tách chiết RNA dựa vào kỹ thuật phòng thí nghiệm tốt và không có sự hiện diện của RNase. RNAse bền nhiệt và đông lại sau khi biến tính nhiệt. Chúng rất khó để bất hoạt vì chúng không yêu cầu các cofactor.

  1. Lịch sử phát triển

Kết tủa thô của DNA cô lập được lần đầu tiên vào năm 1869 bởi Friedrich Miescher. Ban đầu,Miescher đã sử dụng các phương pháp sinh hóa để phân lập DNA – mà ông gọi là nuclein – từ các tế bào bạch cầu và tinh trùng, và xác định rằng nó rất khác với protein (thuật ngữ “axit nucleic” bắt nguồn từ “nuclein.”) Để tách DNA khỏi các protein trong dịch chiết tế bào của mình, Miescher đã phát triển quy trình mới để tách nhân của tế bào khỏi tế bào chất và sau đó tách DNA. Tuy nhiên, giao thức đầu tiên của ông không mang lại đủ tài liệu để tiếp tục phân tích sâu hơn.  Ông đã phải phát triển một giao thức thứ hai để thu được số lượng lớn hơn nuclein tinh khiết, sau này được đặt tên là ‘axit nucleic’ bởi học trò của ông, Richard Altman.

Sau sự kiện định mệnh nơi Miescher tìm cách lấy DNA từ tế bào, quy trình ly trích và tinh sạch DNA theo dòng thời gian từng bước được cải tiến, thay đổi theo hướng ly trích DNA từ nhiều đối tượng mẫu khác nhau, dựa trên các nguyên lý khác nhau. Khi lựa chọn một phương pháp thích hợp để ly trích DNA, điều quan trọng là đảm bảo chất lượng và số lượng của DNA được phân lập để thực hiện các ứng dụng theo sau dự kiến. Các yếu tố khác cần được xem xét để tối ưu hóa phương pháp tách chiết DNA bao gồm thời gian, chi phí, độc tính tiềm ẩn, năng suất, thiết bị phòng thí nghiệm và yêu cầu chuyên môn, cũng như lượng mẫu cần thiết cho quy trình . Trong một thời gian, các phương pháp cách ly khác nhau đã phát triển (Hình 1).

Hình 1: Lịch trình của sự phát triển của các kỹ thuật tách chiết DNA khác nhau

  1. Một số phương pháp ly trích DNA/RNA

Hiện nay, có nhiều phương pháp chuyên biệt để tách chiết DNA, RNA. Hầu hết các quy trình này đã được phát triển thành các bộ kit ly trích thương mại giúp dễ dàng các quá trình chiết xuất phân tử sinh học.

  • Phương pháp tách chiết DNA dựa trên sắc ký

Phương pháp tách chiết DNA dựa trên sắc ký có thể được sử dụng để phân lập DNA từ bất kỳ loại vật liệu sinh học nào. Phương pháp này bao gồm sắc ký dựa trên  kích thước (size exclusion chromatography -SEC), được phát minh bởi Lathe và Ruthven (1955), sắc ký trao đổi ion (ion-exchange chromatography -IEC) được phát triển bởi Peterson và Sober (1956) và sắc ký ái lực (affinity chromatography – AC) được báo cáo bởi Cuatrecasas & Wilcheck . Trong sắc ký loại trừ kích thước (SEC), các phân tử được phân tách theo kích thước và hình dạng phân tử của chúng.  Khi mẫu được cho vào ở phía trên và đi qua cột, các phân tử nhỏ hơn như mRNA và protein đi vào qua các lỗ nhỏ và kênh của các hạt, trong khi DNA bị loại khỏi việc xâm nhập vào các hạt và tránh khỏi chất nền với thể tích thủy động lực học lớn hơn của nó. Do đó, DNA được rửa giải khỏi cột nhanh hơn so với các phân tử nhỏ hơn. SEC thích hợp để sử dụng cho các chất nhạy cảm với sự thay đổi pH và nồng độ ion kim loại.

  • Phương pháp ly tâm gradient EtBr-CsCl

Phương pháp này được phát triển trở lại vào năm 1957 bởi Matthew Meselson, Franklin W. Stahl và Jerome Vinograd . Đầu tiên, DNA được trộn với clorua xêzi (CsCl), dung dịch này sau đó được siêu ly tâm ở tốc độ cao (10.000 đến 12.000 vòng / phút) trong hơn 10 giờ. Quá trình này gọi là ly tâm isopycnic là một kỹ thuật phân tích chúng ta có thể sử dụng để tách các phần tử của dung dịch tùy thuộc vào tỷ trọng, nhưng không phụ thuộc vào kích thước. Điều đó có nghĩa là, chúng ta có thể tách các hạt trong dung dịch nếu chúng khác nhau về khối lượng riêng. Sau quá trình ly tâm, DNA tách khỏi phần còn lại của các chất dựa trên mật độ của nó. Tùy thuộc vào các loại DNA thay đổi theo mật độ, một hoặc nhiều dải DNA xuất hiện khi đạt đến điểm isopycnic (điểm các phần tử có tỷ trọng khác nhau sẽ phân tách) . Ethidium bromide (EtBr) hoạt động như một tác nhân xen phủ và được kết hợp tương đối nhiều hơn vào các phân tử DNA không siêu cuộn hơn là siêu cuộn, do đó cho phép DNA siêu cuộn tích tụ ở mật độ thấp hơn. Vị trí của DNA có thể dễ dàng nhìn thấy dưới ánh sáng cực tím. EtBr và CsCl được loại bỏ trước khi kết tủa DNA với ethanol. Phương pháp này có thể được sử dụng để tách chiết DNA từ vi khuẩn, nhưng cần một lượng lớn nguồn nguyên liệu. Hơn nữa, phương pháp này phức tạp, tốn thời gian và chi phí do thời gian ly tâm siêu tốc độ cao kéo dài.

  • Phương pháp ly giải kiềm (alkaline)

Phương pháp Alkaline được mô tả lần đầu tiên bởi Birnboim và Doly năm 1979. Phương pháp chuyên dùng để tách DNA plasmid từ vi khuẩn. Phương pháp ly trích này hiệu quả với tất cả các chủng E. coli và một số vi khuẩn với sự hiện diện của Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)

Nguyên tắc: Sử dụng chất tẩy rửa có tính kiềm hóa như SDS – NaOH phá màng tế bào, giải phóng DNA. Trong điều kiện môi trường kiềm, DNA bị biến tính trở thành dạng sợi đơn. Sau đó, kali axetat được bổ sung làm giảm độ kiềm của hỗn hợp. Dưới những điều kiện này, liên kết hydro của các DNA chuỗi đơn có thể được thiết lập lại, vì vậy các DNA sợi đơn trở về dạng DNA sợi đôi. DNA plasmid tròn nhỏ nhanh chóng trở về dạng vòng đôi hơn so với DNA genome kích thước lớn. Trong khi các plasmid sợi đôi có thể hòa tan dễ dàng trong dung dịch, các sợi DNA đơn, SDS và các protein biến tính ở trạng thái kị nước tạo kết tủa trắng. Kết tủa có thể dễ dàng tách ra khỏi dung dịch DNA plasmid bằng cách ly tâm.

– Ưu điểm: hiệu quả trong ly trích plasmid, DNA ti thể. Kỹ thuật đơn giản.

– Nhược điểm: Môi trường kiềm nếu không được trung hòa tốt, ảnh hưởng đến chất lượng DNA. DNA ly trích không bảo quản được lâu.

  • Ly trích bằng chất nền silica

Ái lực cao giữa silicat và DNA được Vogelstein và Gillespie mô tả lần đầu tiên vào năm 1979. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc liên kết có chọn lọc của DNA tích điện âm với bề mặt silica được bao phủ bởi các ion tích điện dương. Với DNA liên kết chặt chẽ với chất nền silica, phần còn lại của chất gây ô nhiễm tế bào có thể được rửa sạch trước khi DNA chiết xuất được rửa giải khỏi các hạt silica bằng cách sử dụng nước cất hoặc dung dịch đệm như Tris-EDTA . Các giao thức sửa đổi khác nhau của kỹ thuật này đã được mô tả trong tài liệu, chẳng hạn như việc sử dụng chất nền silica ngậm nước để tách chiết DNA.

Phương pháp silica đơn giản, thực hiện nhanh, tiết kiệm chi phí, thu được DNA chất lượng cao và có thể được sử dụng để tự động hóa. Các bộ dụng cụ có sẵn trên thị trường liên quan đến việc sử dụng nền silica bao gồm bộ tách chiết DNA bộ gen Thermo Fisher Purelink và QIAGEN DNeasy Blood

  • Phương pháp salting-out

Phương pháp tách muối (salting-out) là một phương pháp tách chiết DNA không độc hại được Miller, Dykes và Polesky mô tả vào năm 1988. Mẫu chứa DNA được thêm vào 3mL dung dịch đệm ly giải (0,4 M NaCl, 10 mM Tris – HCl pH 8,0 và 2 mM EDTA, pH 8,0), SDS và proteinase K. Hỗn hợp được ủ ở 55–65 ° С qua đêm. Tiếp theo, khoảng 6M NaCl bão hòa được thêm vào và lắc hỗn hợp trong 15 giây sau đó ly tâm ở 2500 vòng / phút trong 15 phút. Nồng độ muối cao làm giảm khả năng hòa tan của protein, dẫn đến kết tủa. Phần nổi phía trên có chứa DNA được dùng pipet hút vào một ống mới và có thể được kết tủa bằng cách sử dụng ethanol.

Phương pháp này đã được báo cáo là mang lại DNA chất lượng cao tương đương với phương pháp phenol-cloroform, và ưu việt hơn ở hiệu quả về thời gian và chi phí hiệu và quan trọng nhất là thuốc thử được sử dụng không độc hại. Nó cũng được sử dụng để chiết xuất DNA từ máu, nuôi cấy huyền phù hoặc  mô đồng nhất.

  • Phương pháp ly tríchCetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)

Quy trình ly trích phù hợp cho mẫu thực vật và một số vi khuẩn gram âm. Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) là chất tẩy rửa không chứa ion có thể kết tủa axit nucleic và polysaccharide. Đối với tách chiết mẫu thực vật, bước đầu tiên cần làm là nghiền mẫu sau khi đông lạnh bằng nitơ lỏng. Mục đích của việc thực hiện bước này là phá vỡ vật liệu thành tế bào của mẫu và cho phép tiếp cận axit nucleic trong khi các enzym và hóa chất có hại cho tế bào vẫn bị bất hoạt. Sau khi nghiền mẫu một số phòng nghiên cứu tiếp tục quy trình phá mẫu bằng việc ủ với dung dịch ly giải tế bào. 

Tiếp theo là bước tạo phức với CTAB. CTAB có khả năng liên kết thuận nghịch với ADN và polysaccharide, cụ thể ở nồng độ muối cao (trên 1.4 M NaCl có trong đệm chiết) thì CTAB kết hợp với ADN và polysaccharide nhưng phức hợp CTAB-DNA tồn tại ở trạng thái hòa tan, trong khi đó phức CTAB-polysaccharide lại kết tủa. Sau đó, DNA được tinh chế bằng cách sử dụng các dung môi hữu cơ và rượu khác nhau, bao gồm các tác nhân độc hại như phenol và chloroform. Những hạn chế chính của phương pháp này bao gồm việc sử dụng các thuốc thử độc hại và quy trình tốn thời gian.

Tham khảo tài liệu đính kèm

  • Phương pháp Phenol – chloroform

Năm 1953, Grassmann và Deffner phát hiện rằng phenol là chất thích hợp để chiết xuất protein từ dung dịch nước. Kirby (1956), báo cáo phenol ở các điều kiện pH khác nhau cho phép phân tách DNA và RNA ra khỏi protein. Ngay sau đó, 1957, Kirby tìm thấy rằng sự có mặt của muối anion (ví dụ p-aminosalicylate và natri benzoate) giúp tăng lượng DNA và RNA trong quá trình ly trích. Ngày nay, phương pháp Kirby tiếp tục được sử dụng với sự bổ sung một số chất hỗ trợ khác như chất tẩy rửa anion SDS, chloroform và isoamyl alcohol. Phương pháp tách chiết DNA bằng phenol-chloroform được giới thiệu vào năm 1998 bởi Barker và cộng sự.

Ly trích bằng phenol là phương pháp ly trích ra đời sớm nhất, vẫn được sử dụng trong các phòng thí nghiệm và được xem là phương pháp ly trích cơ bản thích hợp cho nhiều đối tượng mẫu.

Nguyên tắc: Phenol là chất biến tính protein mạnh đóng vai trò phá hủy các protein màng, enzyme phân hủy DNA, RNA. Phenol không hòa tan acid nucleic, khi xử lý với hóa chất này, tế bào sẽ bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nội bào: DNA, RNA, protein… Sau khi ly tâm, mẫu xử lý sẽ phân tách thành hai lớp: Lớp dưới là phenol, lớp trên là nước chứa DNAvà RNA, phần protein bị biến tính sẽ nằm ở bề mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ. DNA trong phần dịch nổi ở trên sẽ được thu nhận bằng cách tủa với isopropanol có bổ sung chất trợ tủa (sodium acetat). Muối dư thừa được rửa sạch với ethanol 70%. Ly tâm, hong khô bằng nhiệt để loại bỏ ethanol. Sau đó DNA được hòa tan với đệm TE hoặc nước cất vô trùng.

Việc sử dụng guanidinium isothiocyanate trong chiết xuất RNA lần đầu tiên được đề cập bởi Ulrich et al. (Năm 1977). Phương pháp này tốn nhiều công sức. Do đó, nó đã được thay thế bằng kỹ thuật một bước, được gọi là chiết xuất Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform, bởi Chomczynski và Sacchi (1987– Tham khảo tài liệu đính kèm). Nguyên tắc của kỹ thuật một bước này là RNA được tách khỏi DNA sau khi chiết xuất bằng dung dịch axit bao gồm guanidinium thiocyanat, natri axetat, phenol và chloroform. Trong điều kiện axit, RNA tổng số sẽ vẫn ở trong pha nước phía trên của toàn bộ hỗn hợp, trong khi DNA và protein vẫn ở trong pha giữa hoặc pha hữu cơ thấp hơn. Việc thu hồi RNA tổng số sau đó được thực hiện bằng cách kết tủa với isopropanol.

Phương pháp phenol-cloroform là tiêu chuẩn vàng cho ly trích DNA . Nó có thể được sử dụng để chiết xuất DNA từ máu, nuôi cấy huyền phù hoặc đồng nhất mô. Nó cung cấp năng suất cao và tương đối rẻ. Tuy nhiên, bản chất độc hại của phenol và cloroform đòi hỏi phải sử dụng tủ hút và là hạn chế lớn của phương pháp này. Các mẫu DNA chiết tách có độ tinh khiết cao hơn so với các phương pháp thông thường  nhưng thấp hơn so với các mẫu thu được bằng phương pháp cột. Một ví dụ về bộ dụng cụ có sẵn trên thị trường dựa trên phương pháp này là Thermo Fisher Easy-DNA®

  • SDS-Proteinase K

Proteinase K là một protease serine lần đầu tiên được phát hiện bởi Ebeling và cộng sự trong nấm album Engyodontium năm 1974. Để tách chiết DNA, thường thêm 20–50 µL 10–20 mg / mL proteinase K. Natri dodecyl sulfat (SDS) cũng được thêm vào để hòa tan màng tế bào và vỏ nhân cũng như làm biến tính và mở ra các protein, cho chúng tiếp xúc với hoạt tính protease của proteinase K. Dung dịch sau khi ủ với SDS – Proteinase K ở 50–60 ° С có thể được sử dụng để tách chiết DNA bằng phương pháp phenol-chloroform hoặc salting-out với hiệu suất ly trích tốt hơn.

  • Phương pháp magnetic bead

Magnetic bead là những hạt từ tính được tạo thành từ các hạt ôxít sắt cực nhỏ (20 đến 30 nm), chẳng hạn như magnetit (Fe3O4), mang lại cho chúng đặc tính siêu thuận từ (là đặc tính cho phép các hạt được tách ra ở dạng huyền phù, cùng với bất cứ thứ gì chúng bị ràng buộc. Vì chúng không hút nhau bên ngoài từ trường, chúng có thể được sử dụng mà không cần lo lắng về sự kết tụ không mong muốn).

Năm 1998, Trevor Hawkins đã nộp bằng sáng chế có tiêu đề “Tinh chế và phân lập DNA bằng cách sử dụng các hạt từ tính”. Các hạt nano từ tính phủ kháng thể liên kết DNA hoặc polyme có ái lực cụ thể với DNA có thể được sử dụng để liên kết DNA với bề mặt của nó. Cách tiếp cận, hầu như không thay đổi kể từ đó, dựa vào việc sử dụng các hạt từ tính với lớp phủ có thể liên kết các axit nucleic một cách thuận nghịch chỉ bằng cách điều chỉnh các điều kiện đệm (Hình 2). Tùy vào lớp phủ, hạt từ gắn kết vào các đối tượng đích khác nhau ( DNA, RNA, Protein, các phân tử miễn dịch…)

Hiệu suất DNA thu được bằng phương pháp này có thể so sánh với sản lượng thu được trong các phương pháp thông thường khác và quy trình này đã được chứng minh là mất ít hơn 15 phút để hoàn thành, nhanh hơn nhiều so với các phương pháp thông thường khác có thể mất đến vài giờ. Hơn nữa, nó lý tưởng cho việc tự động hóa và cần ít thiết bị để thực hiện vì nó không phụ thuộc vào quá trình ly tâm. Một ưu điểm khác so với các phương pháp dựa trên ly tâm là kỹ thuật này không liên quan đến việc sử dụng lực cắt có thể làm hỏng tính toàn vẹn của axit nucleic. Tuy nhiên, giao thức này không hiệu quả về chi phí so với các phương pháp khác.

Hình 2:Tổng quan về chiết xuất DNA dựa trên hạt từ tính bằng cách sử dụng hạt Sera-Mag.

https://www.cytivalifesciences.com/en/us/news-center/magnetic-beads-a-simple-guide-10001

  • Cellulose-based paper

Cellulose  là một polyme được hydroxyl hóa có ái lực liên kết cao với DNA. Năm 2000, Whatman, Inc. đã nộp bằng sáng chế có tiêu đề “ Sử dụng Ftacoated media như một công cụ chẩn đoán phân tử”. Thẻ Whatman ™ FTA ™ là một ví dụ về giấy làm từ cellulose có bán trên thị trường được sử dụng rộng rãi để tách chiết DNA. Chúng được ngâm tẩm với chất đệm, chất tẩy rửa và chất tạo chelat để tạo điều kiện cho việc tách chiết DNA.

Việc tách chiết DNA bằng giấy làm từ cellulose nhanh chóng, thuận tiện cao, không yêu cầu chuyên môn sâu trong phòng thí nghiệm và cho phép dễ dàng bảo quản mẫu mà không cần làm lạnh. Tuy nhiên, quá trình xử lý hạ nguồn để thu hồi DNA tinh khiết và cô đặc có thể rất khó khăn

  • Ly trích Chelex-100

Năm 2011, Xiong Hui, Xie Liqun và Chen Jiayi đã được cấp bằng sáng chế cho phương pháp tách chiết DNA bằng cách sử dụng chelex-100. Cột chelex là một chất đồng trùng hợp styrenedivinylbenzen được sử dụng để chelate các ion kim loại hoạt động như cofactor cho DNase với các nhóm axit iminodiacetic của nó. Sau khi ủ qua đêm, dung dịch chelex 5% và proteinase K được sử dụng để phân hủy DNase được thêm vào. Sau đó, mẫu mô được đun sôi trong dung dịch chelex 5% để làm khô các màng còn lại cũng như làm biến tính các protein và DNA. Chelex ngăn không cho DNA bị tiêu hóa bởi các DNase có thể vẫn còn sau khi đun sôi, do đó ổn định quá trình chuẩn bị. Sau đó, DNA sợi đơn thu được có thể được cô đặc khỏi dịch nổi sau khi ly tâm. Ưu điểm của phương pháp này bao gồm giảm nguy cơ nhiễm bẩn và các sai sót kỹ thuật vì quy trình chỉ sử dụng một ống nghiệm duy nhất và một vài bước thao tác. Tuy nhiên, việc thiếu quá trình tinh sạch làm cho phương pháp này không hiệu quả trong việc loại bỏ các chất ức chế PCR. Một hạn chế khác là DNA được phân lập có thể không ổn định và không thích hợp cho phân tích RFLP.

  • Ly trích DNA bằng giấy lọc

Vào năm 2017, Rui Shi và Dilip Panthee mô tả một phương pháp tách chiết DNA bằng cách sử dụng giấy lọc, có thể được sử dụng để phân lập DNA từ các nguồn thực vật. Một đĩa quay bao gồm một đĩa 96 giếng (đáy chữ V) với một lỗ (đường kính khoảng 1 mm) được khoan vào đáy của mỗi giếng được sử dụng, với mỗi giếng chứa một đĩa giấy lọc Whatman ™ (khoảng 8 mm đường kính). Các mẫu được xử lý bằng đệm ly giải được lọc bằng ly tâm. Phương pháp này thay thế các bộ lọc sợi thủy tinh được sử dụng trong các bộ dụng cụ thương mại để tách chiết DNA bằng giấy lọc, do đó làm giảm đáng kể chi phí của phương pháp này

  1. Tổng kết

Kể từ lần tách chiết DNA đầu tiên do Friedrich Miescher thực hiện vào năm 1869, các nhà khoa học đã đạt được tiến bộ phi thường trong việc thiết kế các phương pháp chiết xuất đáng tin cậy hơn, dễ dàng hơn và thực hiện nhanh hơn, tiết kiệm chi phí hơn và tạo ra năng suất cao hơn. Các kỹ thuật mới hơn đáng tin cậy và hiệu quả hơn đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiến bộ trong kiến thức về bộ gen người và đóng một vai trò quan trọng trong sự ra đời của nhiều lĩnh vực khác nhau trong khoa học như chỉnh sửa gen và y học cá nhân hóa. Tuy nhiên, hiện tại dường như không có quy trình duy nhất nào có thể áp dụng cho tất cả các bối cảnh tách chiết DNA do những hạn chế của chúng trong việc tạo ra sản lượng với độ tinh khiết tối ưu và sự tiện lợi khi sử dụng. Do đó, cần có các giải pháp để khắc phục những hạn chế của các kỹ thuật này để có kết quả tốt hơn và đơn giản hóa việc xử lý DNA. Sự cải tiến trong thiết kế các phương pháp hiện có và phát triển các kỹ thuật mới sẽ là động lực để định hướng sự phát triển hơn nữa của công nghệ tách chiết DNA trong tương lai.

Tài Liệu tham khảo:

The Evolution of DNA Extraction Methods

DNA, RNA, and Protein Extraction The Past and The Present

The single-step method of RNA isolation by Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform

pp CTAB

Tin khác

Đối tác

Copyright 2017 ADN LOCI